构建亚细胞定位载体时，GFP融合位置为什么有N端、C端之分？
若序列中存在信号肽，则构建载体时需避开这一端来融合荧光蛋白。需注意不同的融合方式可能会得到不同的定位结果，例如融合在荧光蛋白N端的目标蛋白一般无法得到过氧化物酶体的定位结果；融合在荧光蛋白C端的目标蛋白一般无法得到线粒体、质体的定位结果。
为什么不同的受体材料有时得到的定位结果不一样？
不同物种的细胞在翻译表达基因时，其表达模式和影响因子不同。受物种差异的影响，同一个载体在不同的受体材料中表达的位置可能不同，因此建议实验时尽可能选用与目的基因来源相近的受体材料进行表达。
用水稻原生质体进行亚细胞定位时，为什么不拍摄叶绿体的自发荧光？
经测验，使用水稻黄化苗制备原生质体，载体转化效率及基因表达强度较高，而黄化苗中叶绿体较少，因此水稻原生质体定位拍照时，除非与叶绿体共定位，否则不拍摄叶绿体的自发荧光。
为什么要提供GFP空载的对照图片？
（1）作为整个实验过程中的操作参照，可排除因实验操作而导致目的基因没有荧光信号的影响。
（2）作为载体体系的参照，确认构建载体时所使用的载体是可正常表达荧光蛋白的。
亚细胞定位原理
利用GFP、RFP等荧光蛋白具有的荧光性质和灵敏性，来示踪细胞内的蛋白。将目标蛋白与荧光蛋白的N端或者C端融合，通过瞬转或稳转，使该融合蛋白在受体材料细胞内表达，目标蛋白会牵引荧光蛋白一起定位到目标细胞器，经过激光共聚焦显微镜激光照射，荧光蛋白会发出荧光，通过观察荧光蛋白在细胞内显示的位置，从而可以确定目标蛋白的亚细胞定位情况，即可对蛋白质进行准确定位。
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