RFLP标记是发展最早的DNA标记技术。RFLP是指基因型之间限制性片段长度的差异，这种差异是由限制性酶切位点上碱基的插入、缺失、点突变所引起的。利用这一方法可以测定种群内、种群间不同水平的物种在不同环境下进化水平上的差异。RFLP技术在用于基因型分型研究的同时，同样可用于在不同环境中微生物多样性的研究。 RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism,限制片段长度多态性)，是用特异性引物对混合微生物群体DNA提取物进行PCR扩增，然后用适当的限制性内切酶对扩增产物进行 消化，由于序列的差异，呈现酶切图谱的 DNA多态性。该方法已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。T-RFLP技术依据细菌16S rRNA基因保守区设计通用引物，以待分析样品DNA为模板进行PCR扩增，所得到的PCR产物采用特定的的限制性内切酶进行酶切。由于在细菌之间16S rRNA序列中核苷酸序列的差异，酶切后会产生很多不同长度的限制性片段。通过检测分析这些酶切片段大小即可反应微生物群落组成情况。
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